CCK-8試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA).已知濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然后加入底物A、B,和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中的濃度呈比例關系。
CCK-8試劑盒的操作步驟:
1、配制瓊脂糖EB凝膠,電泳以分離DNA片段。任何類型或等級的瓊脂糖都可以使用。
我們強烈的推薦使用新鮮的TAE/TBE電泳緩沖液。不要重復使用電泳緩沖液,舊的電泳緩沖液PH會增加而降低DNA的回收產量;
2、電泳足夠時間后,在紫外燈下小心地把所需的DNA的片段切下來。并盡量去除多余的凝膠。
注意:DNA在紫外燈下的曝光的時間不要超過30秒,同時在紫外燈下操作的時候一定要戴保護眼鏡。
3、稱取空離心管的重量,切下帶目的片段的凝膠裝在1.5ml離心管中并稱其重量,求出凝膠塊的重量,近似地確定其體積。一般情況下,凝膠的密度為1g/ml,于是凝膠的體積與重量的關系可按下面換算:凝膠薄片的重量為0.2g則其體積為0.2ml;加入等倍凝膠體積的BindingBuffer,把混合物置于55℃~65℃水浴中溫浴7min至凝膠*融化,其間每隔2-3分鐘混勻一次;
重要提醒:在凝膠*溶解之后,注意凝膠-BindingBuffer混合物的pH值。如果其pH值大于8的話,DNA的產量將大大減少。觀察混合物的顏色,如果是橙色或紅色,則要加入5μl濃度為5M,pH為5.2的醋酸鈉,以調低其pH值。經過這一調節,該混合物的顏色將恢復為正常的淺黃色。一般情況下,使用新鮮的電泳緩沖液,凝膠-Bindingbuffer混合物的PH值的不會升高;
4、轉移700μl的DNA-瓊脂糖溶液到一個HiBindTMDNA柱子,并把柱子裝在一個干凈的2ml收集管內,室溫下,10,000×g離心1min,棄去液體。
一個HiBindDNA柱子最多可容納700μl的溶液,如果DNA-瓊脂糖混合物的體積大于700μl,可先轉移700μl溶液至柱子,離心完后,將余下的溶液繼續加上柱子上。但是每一個HiBindTM柱子最多可以結合25~30μgDNA。如果預期產量較大,則把樣品分別加到合適數目的柱中。
5、將柱子重新套回收集管中,加300μlBindingBuffer至HiBindDNA柱子中;室溫下,10,000×g離心1分鐘,去棄濾出液;這一步相當關鍵,不要忽略此步。
6、將柱子重新套回收集管中,加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室溫下,10,000×g離心1分鐘,去棄濾出液;注:SPWWashbuffer在使用前必須按瓶子標鑒要求用無水乙醇進行稀釋。
7、將柱子重新套回收集管中,重復加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室溫下,10,000×g離心1分鐘,去棄濾出液;
8、棄去液體,將空柱子重新套回收集管中,10,000×g離心1min以甩干柱基質殘余的液體。
這步可以去除柱子基質上殘余的乙醇,不要省略此步―――對得到好的DNA產量是十分重要的。
9、把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上,加入30~50μl洗脫液或滅菌水上柱子膜上,10,000×g離心1分鐘,離心管中的溶液就是純化的DNA產物,保存于-20度。