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用細(xì)胞分離液分離組織中單核細(xì)胞方法
更新時(shí)間:2018-06-26 點(diǎn)擊次數(shù):2664次
  用細(xì)胞分離液分離組織中單核細(xì)胞方法
 
  淋巴細(xì)胞分離液是一種根據(jù)細(xì)胞密度差異,借助離心產(chǎn)生的重力加速度,進(jìn)行細(xì)胞的分離純化的常用試劑。常用的淋巴細(xì)胞分離液有Ficoll淋巴細(xì)胞分離液、Percoll淋巴細(xì)胞分離液。Ficoll與Percoll分離單個(gè)核細(xì)胞的方法均為密度梯度離心法。淋巴細(xì)胞分離液是由聚蔗糖、泛影酸葡甲胺、氫氧化鈉等配制成水溶液,經(jīng)滅菌而成。用于分離全血中淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)室常用的是用于分離人的淋巴細(xì)胞的試劑,如果需要分離其他動(dòng)物如小鼠的淋巴細(xì)胞,也有專門的淋巴細(xì)胞分離液。
 
  用淋巴細(xì)胞分離液分離人組織中的單個(gè)核細(xì)胞方法:
  1.取外科分離的各種組織,用含1%慶大霉素和1%小牛血清的MEM培養(yǎng)液洗滌組織塊,洗去可能的污染物。將組織塊置培養(yǎng)皿中,加入約為組織塊體積5~10倍的同樣MEM培養(yǎng)液。用無菌外科剪刀將組織塊剪碎成0.5mm3大小。
  2.將組織塊轉(zhuǎn)移到小培養(yǎng)瓶中,靜置片刻,吸去培養(yǎng)液。加入約2倍組織塊體積的、濾過除菌的酶溶液。37℃水浴搖床中消化1~2小時(shí),注意組織塊的消化程度。
  3.當(dāng)組織塊消化分散后,用手用力搖晃培養(yǎng)瓶3~5分鐘或用大口吸管反復(fù)吹打,使細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步分散。加入30ml上述MEM培養(yǎng)液,終止酶反應(yīng)。
  4.讓上述懸液通過200目的金屬網(wǎng)或尼龍網(wǎng),分離單個(gè)細(xì)胞。用上述MEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,每次離心1000×g 10分鐘。用1%臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力并計(jì)數(shù)細(xì)胞。
  5.如果細(xì)胞量較多(>107),應(yīng)當(dāng)用上述淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞,并用含10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。

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