纖維素(CLL)含量試劑盒說明書 |
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纖維素(CLL)含量試劑盒說明書 可見分光光度法 注意: 正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。 規格:50T/48S 正式測定前取2-3個預期差異較大的樣本做預測定 測定意義: 纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖,通常與半纖維素、果膠和木質素結合在一起,是植物細胞 壁的主要結構成分。纖維素是一種重要的膳食纖維,是自然界中分布最廣、含量最多的 一種多糖。 測定原理: 纖維素為β -葡萄糖殘基組成的多糖,在酸性條件下加熱能分解成β -葡萄糖。β -葡萄糖在強酸作 用下,可脫水生成β -糠醛類化合物。β -糠醛類化合物與蒽酮脫水縮合,生成糠醛衍生物。顏色的深 淺可間接定量測定纖維素含量。 需自備的儀器和用品: 可見分光光度計、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、80%乙醇、丙酮、濃硫酸(不 允許快遞) 、研缽和蒸餾水。 試劑的組成和配制: 試劑一: 液體 50mL× 1 瓶,4℃保存。 試劑二: 粉劑×1 瓶,4℃避光保存。 試劑三: 液體 10mL× 1 支,4℃保存。 標準品: 粉劑10mg× 1支,4℃保存; 含 10mg 無水葡萄糖(干燥失重<0.2%),臨用前加入 1mL 蒸餾水溶解,配制成 10mg/mL 葡萄糖溶液備用,4℃可保存 1 周,或者用飽和苯甲酸溶液溶解, 可保存更長時間。 樣品的前處理: 1 、細胞壁的提取: 取約 0.3g 樣本(計為M1),加入 1mL 80%乙醇,室溫快速勻漿,95℃水浴 20min ,冷卻至室溫,4000g 25℃離心 10min ,棄上清。沉淀加入 1.5mL80%乙醇和丙酮各洗一遍 (渦旋振蕩 2min 左右,4000g 25℃離心 10min ,棄上清即可) ,沉淀即為粗細胞壁,加入 1mL 試 劑一(去除淀粉) 浸泡 15 小時,4000g 25℃離心 10min ,棄上清,1mL 80%乙醇洗滌兩次,棄上 清,將沉淀干燥,稱重得細胞壁物質(CWM質量計為M2)。 2 、纖維素的提取: 稱取烘干的 CWM 約 5mg(計為W),加入 0.5mL 蒸餾水充分勻漿,勻漿液轉移 至 EP 管中,用蒸餾水定容至 0.5mL ,置于冰水浴中,緩慢加入 0.75mL 濃硫酸,混勻,冰水浴中 靜置 30min 。8000g 4℃離心 10min ,取上清液,用蒸餾水稀釋 20 倍后待測。 標準溶液準備: 將10mg/mL 葡萄糖標準液進行二倍稀釋得到 0.2、0. 1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、 0.00156mg/mL 標準溶液備用。 測定步驟: 1 、分光光度計預熱 30min 以上,調節波長至 620nm ,蒸餾水調零。
本產品僅供科學研究使用! 請勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測等用途! 2 、調節水浴鍋至 95 度。 3 、工作液的配制: 在試劑二中加入 4mL 試劑三,充分溶解,如較難溶解,可加熱攪拌; 用 不完的試劑 4℃保存一周; 4 、加樣表(在 EP 管中反應) :
混勻,置 95度水浴中 10min(蓋緊,以防止水分散失) ,冷卻至室溫后,于 620nm 處讀數。 纖維素含量計算: 1 、標準曲線繪制: 以 0.2 、0. 1 、0.05 、0.025 、0.0125 、0.00625 、0.003125 、0.00156mg/mL 葡萄糖標準溶液為橫坐 標,ΔA 為縱坐標繪制標準曲線,得到線性回歸方程 y=kx+b ,將ΔA′代入方程得到 x(mg/mL); 2 、按細胞壁干重計算 纖維素含量(mg/mg 鮮重)=x×稀釋倍數×V 提取÷W 3 、按總樣本質量計算 纖維素含量(mg/mg 鮮重)=x×稀釋倍數×V 提取÷W×(M2÷M1) V 提取: 提取后體積,1.25mL;W:樣品質量,mg;稀釋倍數: 20;M1:總樣本質量,g; M2:細胞壁物質CWM ,g
注意事項 1. 加熱過程中有劇烈反應,震蕩時輕搖,以免壓力過大噴出造成人生傷害。 2. 濃硫酸具有強腐蝕性,建議戴防護手套操作。 3. 如樣本OD值大于1.5 ,可在纖維素提取過程中擴大稀釋倍數,計數過程中乘以對應的稀釋倍數。
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