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單胺氧化酶(MAO)試劑盒說明書微量法

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單胺氧化酶(Monoamine OxidaseMAO)試劑盒說明書

微量法

注意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

MAO(EC1.4.3.4) 主要存在于脊椎動物的各種器官,特別是分泌腺、腦、肝臟,在無脊椎動物、豆類的芽等植物中也存在催化單胺類物質代謝,含量較低,具有重要的生理功能,其活

性能反映肝纖維化的程度。此外,MAO活性異常導致細胞內單胺類神經遞質運轉出現紊亂,從而引發多種病癥。

測定原理:

MAO催化單胺類底物脫氨生成相應的醛,進一步氧化成酸;底物在360nm處有特征吸收峰,測定360nm光吸收下降的速率,計算MAO活性。

自備實驗用品及儀器:

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制:

提取液一:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。

提取液二:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。

試劑一:液體 60mL×2 瓶,4℃保存。

試劑二:液體 2mL×1 管,4℃避光保存。

粗酶液提取:

1. 稱取約0.1g樣品,加1mL預冷的提取液一充分冰浴勻漿,1000g4℃,離心10min,棄沉淀;把上清轉移到另一預冷的離心管,10000g4℃,離心30min,棄上清;加入1mL預冷的提取液二,震蕩混勻,16000g4℃,離心40min,棄上清;沉淀加入預冷的1mL試劑一,震蕩混勻,即粗酶液(可用于可溶性蛋白濃度測定)。

2. 細菌、真菌:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g4℃,離心10min,棄沉淀;把上清轉移到另一預冷的離心管,10000g4℃,離心30min,棄上清;加入1.0mL預冷的提取液二,震蕩混勻,16000g4℃,離心40min,棄上清;沉淀加入預冷的1.0 mL試劑一,震蕩混勻,即粗酶液(可用于可溶性蛋白濃度測定),取上清置于冰上待測。

3. 血清:直接測定。


測定操作表:

1、分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長至360nm

2、操作表


對照管

測定管

酶液(µL


20

試劑一(µL

180

160

試劑二(µL

20

20

混勻,于微量石英比色皿/96孔板,對照管調零,測定360nm 處吸光值A1,然后37℃水浴60min,對照管調零,測定360nm處吸光值 A2。ΔA=A1-A2

注意:空白管只需測定一次。

MAO 活性計算公式:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、按蛋白含量計算

酶活定義:37℃,pH7.6時,每毫克蛋白質1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO 活性(nmol/min/mg prot=ΔA÷ε÷d×V反總÷(V樣× Cpr)÷T= 114×ΔA÷Cpr

2、按樣本質量計算:

酶活定義:37℃,pH7.6時,每克樣品1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO 活性(nmol/min/g=ΔA÷ε÷d×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T = 114×ΔA÷ W

3、按照細胞數量計算

酶活定義:37℃,pH7.6時,每104個細胞1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO 活性(nmol/min/104cell=ΔA÷ε÷d×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細胞數量)÷T

= 114×ΔA÷細胞數量

4、按照液體體積計算

酶活定義:37℃,pH7.6時,每升血清1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO 活性(nmol/min/L=ΔA÷ε÷d×V 反總÷V =114×ΔA

ε :底物摩爾消光系數,1460L/mol/cmd:比色皿光徑,1cmV 反總:反應總體積,0.2mL

V 樣:反應中樣本體積,0.02mLV 樣總:加入提取液體積,1mLCpr:樣本蛋白濃度,mg/mLT:反應時間,60minW:樣本質量,g

b.用 96 孔板測定的計算公式如下

1、按蛋白含量計算

酶活定義:37℃,pH7.6時,每毫克蛋白質1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO 活性(nmol/min/mg prot=ΔA÷ε÷d×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T= 228×ΔA÷Cpr

2、按樣本質量計算:

酶活定義:37℃,pH7.6時,每克樣品1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO 活性(nmol/min/g=ΔA÷ε÷d×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T = 228×ΔA÷ W

3、按照細胞數量計算

酶活定義:37℃,pH7.6時,每104個細胞1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO 活性(nmol/min/104cell=ΔA÷ε÷d×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細胞數量)÷T

= 228×ΔA÷細胞數量

4、 按照液體體積計算

酶活定義:37℃,pH7.6時,每升血清1min內轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO 活性(nmol/min/L=ΔA÷ε÷d×V 反總÷V =228000×ΔA

ε :底物摩爾消光系數,1460L/mol/cmd96孔板光徑,0.5cmV 反總:反應總體積,0.2mLV 樣:反應中樣本體積,0.02mLV樣總:加入提取液體積,1mLCpr:樣本蛋白濃度,mg/mLT:反應時間,60minW:樣本質量,g

注意事項:

1、吸光度變化應該控制在 0.010.8 之間。否則加大樣品量或稀釋樣品,注意計算公式中參

與計算的稀釋倍數要相應改變。

2、樣品蛋白質含量需要另外測定。

實驗代做服務:

 


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