ATP含量試劑盒說明書 |
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ATP含量試劑盒說明書 微量法正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定 測定意義: ATP廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,是生物能量通貨,能荷是描述細胞能量代謝狀態的主要參數。測定ATP含量并且計算能荷,能夠反映能量代謝狀態。 測定原理: 肌酸激酶催化肌酸和ATP反應生成磷酸肌酸,可在700nm下用磷鉬酸比色法檢測磷酸肌酸含量,以此反應ATP含量。 自備儀器和用品: 分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調式移液槍、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。 試劑組成和配制: 酸性提取液:液體 60mL×1 瓶,4℃保存; 堿性提取液:液體 60mL×1 瓶,4℃保存; 試劑一:粉劑×1 支,4℃保存;臨用前加入 1mL 蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑 4℃ 保存; 試劑二:液體 1.5mL×1 支,4℃保存; 試劑三:粉劑×1 瓶,4℃保存;臨用前加入 500μL 蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑 4℃保存一周; 試劑四:液體 5mL×1 瓶,4℃保存; 試劑五:液體 25mL×1 瓶,4℃保存; 標準液:液體 10mL×1 瓶,2μmol/mLATP 標準液,4℃保存; ATP 提取: 1、血清(漿)中ATP的提取:按照血清(漿)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約0.1mL血清(漿),加入1mL酸性提取液),進行冰浴勻漿,8000g 4℃離心 10min;取上清液至另一EP管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,8000g4 ℃ 離心 10min,取上清,置冰上待測(不可用于蛋白質含量測定)。 2、組織中 ATP 的提取:按照組織質量(g):酸性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL酸性提取液),進行冰浴勻漿,8000g 4℃離心10min,取上清至另一EP管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(不可用于蛋白質含量測定)。 3、細胞或細菌中ATP的提取:先收集細胞或細菌到離心管內,棄上清,按照細菌或細胞數量(104 個):酸性提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL 酸性提取液),超聲波破碎1min(冰浴,強度20%或200W,超聲2s,停1s),8000g 4 ℃離心10min;取上清液至另一EP管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,8000g 4℃ 離心 10min,取上清,置冰上待測(不可用于蛋白質含量測定)。
測定步驟: 1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長到700nm,蒸餾水調零。 2、顯色劑的配制:臨用前請根據擬用顯色劑體積(樣本數×0.2 mL),按試劑四(mL):試劑五(mL)=1:5 的比例配制。用多少配多少。 3、樣本測定:
37℃水浴20min后,700nm下測定各管吸光值 注意 :空白管和標準管通常只需要各做一個。每個測定管設一個對照管。 ATP 含量計算: 1、血清(漿)中ATP含量計算 ATP含量(μmol/mL)=[C標準管×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×V1]÷(V3×V1÷ V2)=40×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管) 2、組織、細菌或細胞中ATP含量計算 (1) 按蛋白濃度計算 ATP含量(μmol/mg prot)=[C標準管×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×V1]÷(V1÷ Cpr)=2×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷Cpr 蛋白質含量需要另外測定。 (2) 按樣本鮮重計算 ATP含量(μmol/g 鮮重)=[C標準管×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×V1]÷(W×V1÷ V2)=4×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷W (3) 按細菌或細胞密度計算 ATP含量(μmol/104cell)=[C標準管×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)×V1]÷(500× V1÷V2)=0.008×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷W C 標準管:標準液濃度,2μmol/mL;V1:加入反應體系中樣本體積,0.01mL;V2:加入提取液體積,2mL;V3:加入血清(漿)體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL; W:樣本質量, g;500:細胞或細菌總數,500 萬。 注意:低檢測限為 10nmol/mL 或10nmol/g鮮重或 0.1nmol/mg prot
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