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輔酶ⅠNAD(H)含量測定試劑盒說明書

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輔酶NAD(H)含量測定試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取 2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

輔酶 NAD(H)Ⅰ廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要氫受體,生成的 NADH 經(jīng)呼吸電子鏈(ETC)傳遞把電子交給氧,在合成 ATP 的同時,形成大量的 ROS,同時 NADH 再生為 NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于評價糖酵解和TCA循環(huán)的強弱。較高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高,處于過氧化狀態(tài)。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外,NAD+降解產(chǎn)物對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝和基因表達等具有重要的調(diào)控作用。

測定原理

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+和NADH,NADH通過PMS的遞氫作用,還原氧化型噻唑藍(MTT)為甲瓚,在570nm下檢測吸光值;而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH,進一步采用MTT還原法檢測。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

酸性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

堿性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

試劑一:液體 10 mL×1 瓶,4℃保存;

試劑二:液體 3 mL×1 瓶,4℃保存;

試劑三:粉劑×1 瓶,-20 ℃保存,用時加入3mL蒸餾水,混勻,用不完的試劑4℃保存一周;

試劑四:粉劑×1 瓶,4 ℃保存,用時加入3mL蒸餾水,混勻,用不完的試劑4℃保存一周;

試劑五:液體 3.6mL×1 瓶,4 ℃保存;

試劑六:液體 30mL×1 瓶,4 ℃保存;

試劑七:液體 50mL×1 瓶,4 ℃保存。

NAD+和NADH的提取

1  血清(漿)中 NAD+和NADH的提取

NAD+的提取:按照血清(漿)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取約0.1mL血清(漿),加入1mL酸性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);

冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入500μL堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

NADH 的提取:按照血清(漿)體積(mL):堿性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建

議取約0.1mL 血清(漿),加入 1mL 堿性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

2  組織中 NAD+和NADH 的提取:

NAD+的提取:按照組織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取約0.1g組織,加入1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

NADH 的提取:按照組織質(zhì)量(g):堿性提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議取約 0.1g組織,加入 1mL 堿性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

3  細(xì)胞或細(xì)菌中NAD+和NADH的提取:

NAD+的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):酸性提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL酸性提取液),超聲波破碎 1min(冰浴,強度20%或200W,超聲2s,停1s),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL上清液,加入500μL堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

NADH 的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):堿性提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL堿性提取液),超聲波破碎 1min(冰浴,強度 20%或 200W,超聲2s,停1s),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

測定步驟:

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至570nm,蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加樣):

試劑名稱(μL)

對照管

測定管

樣本

20

20

試劑一

80

80

試劑二

30

30

試劑三

30

30

試劑四

30

30

試劑五

30

30

試劑六

200

混勻,室溫避光靜置 20min

試劑六

 

200

充分混勻,靜置 5min 后,20000g,25℃離心 5min,棄上清,沉淀中加入:

試劑七

400

400

混勻,取200μL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或96孔板中,570nm下讀取對照吸光值A(chǔ)1和測定管吸光值 A2,計算△A=A2-A1。

注意事項

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多,可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別:對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六;測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管,本試劑盒100管保證測48個NAD+或 NADH.

NAD+和NADH含量的計算

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(一)NAD+含量的計算

1、血清(漿)中 NAD+含量計算

NAD+含量(nmol/mL)=[(△A -0.099)×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(△A -0.099)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD+含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NAD+(nmol/mg prot)=[(△A-0.099)×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)

=36.1×(△A-0.099)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NAD+(nmol/g 鮮重)= [(△A-0.099)×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)

= 72.2×(△A -0.099)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

NAD+(nmol/104cell)=[(△A -0.099)×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(△A -0.099)

(二)NADH 含量的計算

1、血清(漿)中NADH含量計算

NADH 含量(nmol/mL)= [(△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(△A -0.065)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH 含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADH (nmol/mg prot)= [(△A-0.065)×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr)

= 24.7×(△A -0.065)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NADH (nmol/g 鮮重)= [(△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2)

= 49.4×(△A -0.065)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

NADH (nmol/104cell)= [(△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2)

=0.0988×(△A -0.065)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V2:加入提取液體積,2mL;V3:加入血清(漿)體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

(一)NAD+含量的計算

1、血清(漿)中 NAD+含量計算

NAD+含量(nmol/mL)=[ (△A -0.099)×72.2×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 1444×(△A -0.099)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD+含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NAD+ (nmol/mg prot)=[(△A-0.099)×72.2×V1)]÷(V1×Cpr)

= 72.2×(△A -0.099)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NAD+ (nmol/g 鮮重)= [(△A-0.099)×72.2×V1)]÷(W×V1÷V2)

= 144.4×(△A -0.099)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

NAD+(nmol/104cell)=[(△A -0.099)×72.2×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.2888×(△A -0.099)

(二)NADH 含量的計算

1、血清(漿)中 NADH 含量計算

NADH 含量(nmol/mL)= [(△A -0.065)×49.4×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 988×(△A -0.065)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH 含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADH (nmol/mg prot)= [(△A-0.065)×49.4×V1) ]÷(V1×Cpr)

= 49.4×(△A -0.065)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NADH (nmol/g 鮮重)= [(△A -0.065)×49.4×V1) ]÷(W×V1÷V2)

= 98.8×(△A -0.065)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

NADH (nmol/104cell)= [(△A-0.065)×49.4×V1) ]÷(500×V1÷V2)

=0.1976×(△A -0.065)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V2:加入提取液體積,2mL;V3:加入血清(漿)體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。

注意:低檢測限為 1nmol/mL 或 或 1nmol/g  鮮重 或 或 0.01nmol/mg prot

 

 

實驗代做服務(wù):

ELISA試劑盒免費代檢測

CCK8檢測

基因組DNA提取

 

蛋白相互作用分析

Western Blot

 

免疫組化

熒光定量PCR

動物模型服務(wù)

流式細(xì)胞檢測

細(xì)胞增殖

激光共聚焦

DNA甲基化實驗

細(xì)胞劃痕

鈣離子濃度檢測

掃描電鏡實驗

microRNA 測序

動物實驗

Taqman探針

ATP/ADP檢測

 

石蠟/冰凍切片

定點突變

線粒體膜電位(MMP)檢測

細(xì)胞生長曲線的測定

藥理毒理動物實驗

 

免疫共沉淀

真核表達載體構(gòu)建

染色質(zhì)免疫沉淀CHIP

非標(biāo)定量(Label-free)實驗

滬公網(wǎng)安備 31011802001678號

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