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過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)試劑盒說(shuō)明書(shū)

可見(jiàn)分光光度法

試劑的組成：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體×2瓶，4℃保存；用時(shí)每瓶加入5mL試劑一；用不完的試劑4℃保存一周；

試劑三：液體10 mL×1瓶，4℃保存。

測(cè)定意義：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可催化過(guò)氧化氫氧化酚類(lèi)和胺類(lèi)化合物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類(lèi)、胺類(lèi)毒性的雙重作用。POD催化H₂O₂氧化特定底物，在470nm有特征光吸收。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水

操作步驟：

• 粗酶液提取：

• 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

• 血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

• 測(cè)定步驟和加樣表：

測(cè)定前將試劑一、二和三37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）放置10min。在1mL玻璃比色皿中按順序加入上述試劑，立即混勻并計(jì)時(shí)，記錄470nm下30s時(shí)的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2。計(jì)算ΔA＝A2-A1。

注意：

• 若一次性測(cè)定樣本較多，可將試劑一、二、三和蒸餾水按比例配成混合液，在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）放置10min以上，測(cè)定時(shí)加入15µL樣本和1055µL混合液測(cè)定。
• 如果ΔA小于0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到5min。如果ΔA大于0.5，可將樣本用提取液稀釋后測(cè)定，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

三、POD活性計(jì)算：

• 血清（漿）POD活性

單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

計(jì)算公式：POD（U/mL）=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T =7133×ΔA

• 組織、細(xì)菌或細(xì)胞POD活性

• 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr

• 按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W

• 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =14.27×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.07mL； V樣：加入樣本體積，0.015mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：