SuperRT一步法RT-PCR試劑盒說明書
SuperRT One Step RT-PCR Kit
目錄號:YJ0742
保存條件:-20℃保存。
組分說明
Cat. No. YJ0742
Kit Size 100
SuperRT OneStep RT-PCR EnzymeMix 50 μl
2×OneStep RT-PCR Buffer 1.4 ml
RNase-Free Water 1 ml
本產(chǎn)品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途
產(chǎn)品簡介
本試劑盒是專為一步法RT-PCR實驗研制,逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同一反應體系中進行,
反應過程中無需添加試劑,無需打開管蓋,在避免污染的同時提高了檢測靈敏度和實驗
效率。本試劑盒包括全新逆轉(zhuǎn)錄酶、快速熱啟動DNA聚合酶,同時包含適用于逆轉(zhuǎn)
錄和PCR擴增的反應緩沖液和實驗中所必需的其它組分。SuperRT逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活
性缺失,減少了逆轉(zhuǎn)錄反應中 RNA的降解。該逆轉(zhuǎn)酶逆轉(zhuǎn)錄效率高,可對少量 RNA模
板進行良好的逆轉(zhuǎn)錄反應。 PCR反應使用的快速熱啟動 DNA聚合酶具有擴增效率高、
特異性強、延伸速度快的優(yōu)良性能。*的緩沖體系使逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶同時發(fā)揮zui大
功效。使用本試劑盒擴增得到的目的產(chǎn)物3′端附有一個″A″堿基,可直接用于T/A克隆。
注意事項
1.在操作過程中應避免RNase污染,防止RNA降解或?qū)嶒炛械慕徊嫖廴?,建議在專門
的區(qū)域進行RNA操作,使用專門的儀器和耗材,操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)
常更換手套。
2.實驗盡量使用一次性塑料器皿,若使用玻璃器皿,應使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙
酯)水溶液在37℃處理12小時,并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用,或者將玻璃
器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應使用 0.1%的DEPC
處理后進行高壓滅菌。
3.本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻,盡量避免起泡,并經(jīng)短暫離心
后使用。所涉及的酶類使用后應盡快放回-20℃,避免反復凍融。
4.本試劑盒必須使用特異性引物,引物的選擇可根據(jù)具體實驗來選擇,引物設計的好
壞直接影響到RT-PCR 反應的結(jié)果,設計引物時需考慮GC含量,引物長度,引物
位置,PCR產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)等因素,建議采用專業(yè)的引物設計軟件來設計。
使用方法
1.將RNA模板、引物、 OneStep RT-PCR Buffer、SuperRT OneStep RT-PCR
EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。
2.根據(jù)以下表格配制反應體系:
試劑 25 μl反應體系 終濃度
2×One Step RT-PCR Buffer 12.5 μl 1×
Forward Primer,10 μM 1 μl 0.4 μM
Reverse Primer,10 μM 1 μl 0.4 μM
SuperRT OneStep RT-PCR EnzymeMix 0.5 μl
RNA Template X μl 1 pg – 1 μg
RNase-Free water up to 25 μl
注意:引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下,可提高引物的濃度;發(fā)生非特異性反應時,可降低引物濃度,由此優(yōu)化反應體系。
3.渦旋震蕩混勻,短暫離心,將溶液收集到管底。
4.將熱循環(huán)儀預熱到45℃,將PCR管置于熱循環(huán)儀中,進行RT-PCR反應。
反應條件:
步驟 溫度 時間
反轉(zhuǎn)錄 45℃ 30 min
PCR預變性 95℃ 2 min
變性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s 30-40個循環(huán)
延伸 72℃ 30 s
終延伸 72℃ 5 min
注意:1)一般PCR實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃,退火時間一般為20-30秒,無法得到理想的擴增效率時,適當降低退火溫度;發(fā)生非特異性反應時,提高退火溫度,由此優(yōu)化反應條件。
2)延伸時間根據(jù)擴增的片段大小設定,本產(chǎn)品中包含的DNA Polymerase擴增效率為1 kb/30s。
3)可根據(jù)擴增產(chǎn)物的下游應用設定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少,擴增量不足;循環(huán)次數(shù)多,錯配機率會增加,非特異性背景嚴重。所以,在保證產(chǎn)物得率的前提下,應盡量減少循環(huán)次數(shù)。
5.反應結(jié)束后取5 μl反應產(chǎn)物,加入適量上樣緩沖液后進行電泳檢測結(jié)果。
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相關(guān)產(chǎn)品信息
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