纖維素(CLL)含量試劑盒說(shuō)明書(shū)
可見(jiàn)分光光度法
注意: 正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
規(guī)格:50T/48S
正式測(cè)定前取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖,通常與半纖維素、果膠和木質(zhì)素結(jié)合在一起,是植物細(xì)胞
壁的主要結(jié)構(gòu)成分。纖維素是一種重要的膳食纖維,是自然界中分布最廣、含量最多的 一種多糖。
測(cè)定原理:
纖維素為β -葡萄糖殘基組成的多糖,在酸性條件下加熱能分解成β -葡萄糖。β -葡萄糖在強(qiáng)酸作 用下,可脫水生成β -糠醛類(lèi)化合物。β -糠醛類(lèi)化合物與蒽酮脫水縮合,生成糠醛衍生物。顏色的深 淺可間接定量測(cè)定纖維素含量。
需自備的儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、80%乙醇、丙酮、濃硫酸(不 允許快遞) 、研缽和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一: 液體 50mL× 1 瓶,4℃保存。
試劑二: 粉劑×1 瓶,4℃避光保存。
試劑三: 液體 10mL× 1 支,4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品: 粉劑10mg× 1支,4℃保存; 含 10mg 無(wú)水葡萄糖(干燥失重<0.2%),臨用前加入 1mL 蒸餾水溶解,配制成 10mg/mL 葡萄糖溶液備用,4℃可保存 1 周,或者用飽和苯甲酸溶液溶解, 可保存更長(zhǎng)時(shí)間。
樣品的前處理:
1 、細(xì)胞壁的提取: 取約 0.3g 樣本(計(jì)為M1),加入 1mL 80%乙醇,室溫快速勻漿,95℃水浴 20min ,冷卻至室溫,4000g 25℃離心 10min ,棄上清。沉淀加入 1.5mL80%乙醇和丙酮各洗一遍 (渦旋振蕩 2min 左右,4000g 25℃離心 10min ,棄上清即可) ,沉淀即為粗細(xì)胞壁,加入 1mL 試 劑一(去除淀粉) 浸泡 15 小時(shí),4000g 25℃離心 10min ,棄上清,1mL 80%乙醇洗滌兩次,棄上 清,將沉淀干燥,稱(chēng)重得細(xì)胞壁物質(zhì)(CWM質(zhì)量計(jì)為M2)。
2 、纖維素的提取: 稱(chēng)取烘干的 CWM 約 5mg(計(jì)為W),加入 0.5mL 蒸餾水充分勻漿,勻漿液轉(zhuǎn)移 至 EP 管中,用蒸餾水定容至 0.5mL ,置于冰水浴中,緩慢加入 0.75mL 濃硫酸,混勻,冰水浴中 靜置 30min 。8000g 4℃離心 10min ,取上清液,用蒸餾水稀釋 20 倍后待測(cè)。
標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)備:
將10mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行二倍稀釋得到 0.2、0. 1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、 0.00156mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
測(cè)定步驟:
1 、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 620nm ,蒸餾水調(diào)零。
本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用! 請(qǐng)勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測(cè)等用途!
2 、調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度。
3 、工作液的配制: 在試劑二中加入 4mL 試劑三,充分溶解,如較難溶解,可加熱攪拌; 用 不完的試劑 4℃保存一周;
4 、加樣表(在 EP 管中反應(yīng)) :
試劑(μL) | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 測(cè)定管 |
樣本 | 300 | |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 300 | |
工作液 | 70 | 70 |
濃硫酸 | 630 | 630 |
混勻,置 95度水浴中 10min(蓋緊,以防止水分散失) ,冷卻至室溫后,于 620nm 處讀數(shù)。 纖維素含量計(jì)算:
1 、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制:
以 0.2 、0. 1 、0.05 、0.025 、0.0125 、0.00625 、0.003125 、0.00156mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐
標(biāo),ΔA 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得到線(xiàn)性回歸方程 y=kx+b ,將ΔA′代入方程得到 x(mg/mL);
2 、按細(xì)胞壁干重計(jì)算
纖維素含量(mg/mg 鮮重)=x×稀釋倍數(shù)×V 提取÷W
3 、按總樣本質(zhì)量計(jì)算
纖維素含量(mg/mg 鮮重)=x×稀釋倍數(shù)×V 提取÷W×(M2÷M1)
V 提取: 提取后體積,1.25mL;W:樣品質(zhì)量,mg;稀釋倍數(shù): 20;M1:總樣本質(zhì)量,g; M2:細(xì)胞壁物質(zhì)CWM ,g
注意事項(xiàng)
1. 加熱過(guò)程中有劇烈反應(yīng),震蕩時(shí)輕搖,以免壓力過(guò)大噴出造成人生傷害。
2. 濃硫酸具有強(qiáng)腐蝕性,建議戴防護(hù)手套操作。
3. 如樣本OD值大于1.5 ,可在纖維素提取過(guò)程中擴(kuò)大稀釋倍數(shù),計(jì)數(shù)過(guò)程中乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
從2011年開(kāi)始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)外包及論文潤(rùn)色服務(wù),協(xié)助客戶(hù)各類(lèi)實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤(rùn)色,是客戶(hù)您值得信賴(lài)的科研合作伙伴!
如果您受時(shí)間、試驗(yàn)條件等限制而無(wú)法完成您的課題研究,歡迎您與我們聯(lián)系。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):