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一步法快速WB(HRP)試劑盒(兔)常見問題解答
點擊次數:2529 更新時間:2021-04-01

一步法快速WBHRP)試劑盒(兔)說明書

 

One Step Western Kit HRP (Rabbit)

目錄號:K2029

保存條件:2-8℃保存,避免冷凍。

 

 組分說明

 Cat. No.             K2029                K2029A         K2029B

Kit Size               10                            2             50

封閉液        125 ml                     3 0ml        500 ml

抗體反應液     HRP(兔)1 ml      2 0 0μl     5×1 ml

抗體稀釋液     125 ml                       3 0m l       500 ml

漂洗液(10×) 125 ml                      3 0 m l        500 ml

 

 本產品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途產品簡介

 

  一步法快速WB試劑盒(兔)是上海研謹生物近期推出的Western Blot檢測試劑盒,能夠在1小時左右得到高質量的Western Blot結果,且操作簡便、檢測靈敏度高、背景低、不需再加入二抗、系統穩(wěn)定性強。常規(guī)的Western Blot間接法檢測過程(封閉、一抗結合和二抗結合)需要較長的時間,實驗流程復雜且需要多步條件優(yōu)化。膠上的蛋白轉移到載體膜上后,使用試劑盒中的封閉液孵育5 min,再用抗體反應液處理后的一抗孵育載體膜,經洗滌三次(每次5 min)后,即可進行發(fā)光或顯色檢測。本試劑盒針對目的蛋白一抗為兔來源的實驗系統使用。

 

注意事項

 

1. 客戶需自己準備兔來源的一抗。

2. 使用封閉液、抗體稀釋液(兔)、漂洗液之前請充分混勻。

3. 漂洗液如在2-8℃保存時出現沉淀,請恢復到室溫,把沉淀溶解后正常使用,1×漂

洗液可在室溫保存一個月。

4. 建議轉膜完成后用麗春紅等試劑染色,并把膜上多余部分剪去以增加試劑的使用效

率。

5. 一抗和抗體反應液HRP(兔)需要通過預實驗來確定最*+佳的稀釋用量。

6. 抗體反應液HRP(兔)、抗體稀釋液和抗體用量可根據膜的大小按比例放大或減少。

7. 加入一抗的抗體稀釋液可以回收重復使用一次。特異性及親和力低的抗體不建議重

復使用。回收后抗體如在1-2天內使用放置在2-8℃,長期保存請在-20℃凍存,避

免多次反復凍融。

8. 如果存在較高背景的情況,請調整抗體的用量,并增加洗膜次數。

9. 試劑盒內所有試劑請于2-8℃保存,避免凍融。

 

操作步驟

 

本產品適用于轉膜完成后的封閉及抗體孵育步驟,以5 cm×8 cm 膜為例:

1.漂洗液準備:取10 ml 10×漂洗液用蒸餾水稀釋至100 ml待用。每次洗膜用8-10 ml

2.轉膜完成后,將膜浸沒到10 ml封閉液中,室溫封閉5分鐘。

3.倒掉封閉液,加入8-10 ml 1×漂洗液,于搖床上用較大速度漂洗1分鐘。

4.洗膜的同時可準備抗體孵育液:取抗體反應液HRP(兔)100 μlEP管中,加入兔

源一抗3-10 μg,槍頭吸打至充分混勻,室溫孵育5分鐘。

5.將混勻的抗體與反應液HRP(兔)混合液加入到10 ml 抗體稀釋液中,充分混勻。

 

    注意:1)一抗的用量也可根據抗體的稀釋度來進行調整。以抗體的最終稀釋度1:1000為例,取100 µl抗體反應液HRP(兔)到EP管中,加入10 µl一抗,加入到10 ml 抗體稀釋液中,充分混勻,室溫孵育5分鐘。

 

   2)如果膜面積較小,可按比例減少抗體、反應液及稀釋液的用量。

6.步驟3中,洗膜完成后,倒掉漂洗液,將混合一抗、反應液及稀釋液的抗體孵育液

加到膜上(確保孵育液*浸沒膜表面),在搖床上以60rpm左右的速度室溫孵育40分鐘。

7.棄去(回收)抗體稀釋液,用1×漂洗液漂洗3-5次,每次3分鐘。

8.進行后續(xù)檢測。建議采用ECL試劑盒(K0049)進行檢測。

 

  常見問題解答                

    

 信號太弱或者看不到條帶

原因

a蛋白上樣量太少

b蛋白轉膜效率太低

c一抗親和力較低

解決方案:

a進行SDS-PAGE電泳時加大上樣量。

b優(yōu)化轉膜時間或者電流,確保轉膜時膜與膠之間沒有氣泡。

c增加膜在溶液(含有mixture 1WB-2)中的孵育時間。

 增加抗體濃度可以增加信號。

d 對于低親和力抗體來說,減少洗膜時間可以增加信號。     

由每次10min,減少到每次5min可以增加信號。                 

                                   

 背景偏高

原因

a一抗使用過量

b一抗有非特異性結合或者與封閉試劑有交叉反應

c洗膜時間太短

d曝光顯影時間過長

e容器或者試劑被污染

解決方案:

A減少一抗的使用量,相應的減少WB-1用量。

B使用pretreat A-bM01052)。 客戶還可以使用Quick Block Optimization kit 來找到最*+佳的封閉試劑。

C增加洗滌的步驟可以進一步的降低背景。

D減少曝光時間。如果信號和背景都高,可以等待一段時間,等背景信號減弱后,再進行曝  光。

e每次洗滌的時候使用清潔的容器。帶手套,使用清潔的鑷子處理膜。

 

   

實驗代做服務:

 

WB代做

HE染色

免疫熒光染色

蛋白相互作用分析

ELISA免費代檢測

免疫組化

熒光定量PCR

番紅O固綠染色

流式細胞檢測

激光共聚焦

透射電鏡服務

DNA甲基化實驗

免疫共沉淀(Co-IP

DNA甲基化

掃描電鏡實驗

microRNA 測序

半定量RT-PCR

分子克隆和質粒載體構建服務

原位雜交(FIsh

石蠟/冰凍切片

RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP

CCK8檢測

蛋白雙向(2-D)電泳

蛋白雙向2D-WB

ATP/ADP檢測

Taqman探針

細胞劃痕

基因組DNA提取

 

    

                   

    

        

 

 

滬公網安備 31011802001678號

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