酶聯免疫電擴散測定技術
酶聯免疫電擴散是免疫電擴散(Immunoelectrodiffusion,簡稱IED)與免疫酶技術相結合的樣新技術,其原理在于通過免疫電擴散,抗原與該抗原相應的IgG快速形成免疫復合物,接著用酶標記的抗IgG免疫球蛋白與免疫復合物孵育結合,然后用底物顯色。
酶聯免疫電擴散技術增加了免疫電擴散的靈敏度,對分析復雜的抗原反應和不同類型的免疫球蛋白,都有作用。
電泳儀(包括電泳槽);醋酸纖維薄膜(2.5cm×17cm);微升吸管;大號培養皿等實驗用玻璃器皿。
可溶性抗原溶液;該抗原相應的兔抗血清;HRP標記的抗兔IgG抗體,其中特異性抗體蛋白的濃度為1.25mg/ml;0.1mol/LpH8.2巴比妥緩沖液;0.2%Haemosol溶液;0.1mol/L Ph7.6Tris緩沖液;0.01mol/LpH7.2 PBS;洗滌液(85gNaCI,500ml巴比妥緩沖液,蒸餾水加至1000ml);底物與供氫體溶液(H2O2與DAB-4HC1)。
⑴在醋酸纖維薄膜上用軟鉛筆劃好點樣線,每條點樣線距離膜邊3cm,對距11cm,在每條點樣線中間用軟鉛筆劃好點樣點。
⑵在0.1mol/LpH8.2巴比妥緩沖液中浸濕,滴干水,但要保持濕潤。
⑶用微升吸管點樣,一點加抗原3ul(或1ul),另一點加兔抗待測抗原的血清15ul(或5ul),每份點樣的抗原濃度為0.001-50ug.
⑷電泳條件。用濕濾紙搭橋,電泳緩沖液為0.1mol/L pH8.2巴比妥緩沖液,電流強度為1mA/cm,電泳時間為2h,抗原端接負極。
⑸電泳完畢,將薄膜浸入洗滌液30min,去多余的血清蛋白與游離抗原。
⑹將薄膜浸入0.01mol/L pH 7.2PBS中,振蕩洗滌30min,取出薄膜,滴干余水。
⑺將酶標記抗體以1:50稀釋。
⑻用稀釋的酶標記抗體在室溫孵育2h.
⑼在0.2%Haemosol溶液中振蕩洗滌15min.
⑽在Tris緩沖液中振蕩浸洗30min.
⑾在底物溶液中浸1min后,觀察顯色結果。
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