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谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px) 試劑盒說(shuō)明書(shū)
點(diǎn)擊次數(shù):2582 更新時(shí)間:2020-09-04

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)

試劑盒說(shuō)明書(shū)

紫外分光光度法

注意:正是測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

產(chǎn)品內(nèi)容

試劑一:液體×1 瓶,4保存。

試劑二:粉劑×1 瓶,4保存。

試劑三:液體×1 支,-20保存。

混合試劑配制:臨用前,在試劑二中加入試劑一40 mL,充分震蕩溶解后加入全部試劑三,混勻。(注意:必須現(xiàn)配現(xiàn)用,當(dāng)天使用完

試劑四:液體×1 瓶,4保存。

產(chǎn)品說(shuō)明:

GSH-Px 是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化還原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。GSH-Px不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與ROS反應(yīng),生成氧化型谷胱甘肽GSSG,從而保護(hù)生物膜免受ROS 的損害,維持細(xì)胞的正常功能;而且具有保護(hù)肝臟、提高機(jī)體免疫力、拮抗有害金屬離子對(duì)機(jī)體的傷害和增加機(jī)體抗輻射等能力。

GSH-Px 催化H2O2氧化GSH,產(chǎn)生GSSG;谷胱甘肽還原酶(GR)催化NADPH 還原GSSG,再生GSH,同時(shí)NADPH 氧化生成NADP+;NADPH 340 nm有特征吸收峰,而NADP+沒(méi)有;通過(guò)測(cè)定340 nm光吸收減少速率來(lái)計(jì)算GSH-Px 活性。

自備儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水。

操作步驟:

一、粗酶液提?。?/span>

1. 組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體積(mL)15~10 的比例(建議稱(chēng)取0.1g 組織,加入1mL 試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。10000rpm4離心10min,取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量104個(gè):試劑一體積(ml500~1000:1 的比例,建議500 萬(wàn)細(xì)胞加入1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(率300w,超聲3 s,間隔7s,總時(shí)間3min)然后10000rpm,4,離心10min,取上清置冰上待測(cè)。

3. 血清等液體:直接測(cè)定。

二、測(cè)定操作:

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 混合試劑在25或者37(哺乳動(dòng)物)水浴中預(yù)熱30min 以上。

3. 空白管:依次在1mL石英比色皿中加入100μL 蒸餾水、800μL 預(yù)熱的混合試劑,100μL試劑四,迅速混勻后于340nm處測(cè)定第10 s和第190s的吸光值,分別記為A1A2,A 空白管= A1A2。

4. 測(cè)定管:依次在1mL 石英比色皿中加入100μL 上清液、800μL 預(yù)熱的混合試劑,100μL試劑四,迅速混勻后于340nm 處測(cè)定第10 s和第190s 的吸光值,分別記 A測(cè)1 A測(cè)2A 測(cè)定管= A測(cè)1A測(cè)2。

注意:空白管只需測(cè)定一次。

三、GSH-Px 活性計(jì)算:

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

GSH-Px 活力單位定義:一定溫度中,每 mg 蛋白每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個(gè)酶活單位。

GSH-Px (U/mg prot)=[(A 測(cè)定管-A 空白管)÷ε÷d×V 反總×109 Cpr×V 樣)÷T

=536×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

GSH-Px 活力單位定義:一定溫度中,每g 樣本每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個(gè)酶活單位。

GSH-Px (U/g)=[(A 測(cè)定管-A 空白管)÷ε÷d×V 反總×109W×V ÷V樣總)÷T

=536×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

GSH-Px 活力單位定義:一定溫度中,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個(gè)酶活單位。

GSH-Px (U/104 cell)=[(A測(cè)定管-A空白管)÷ε÷d×V反總×109(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

=536×(A測(cè)定管-A空白管細(xì)胞數(shù)量

(4). 按液體體積計(jì)算

GSH-Px 活力單位定義:一定溫度中,每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH 氧化為1個(gè)酶活單位。

GSH-Px (U/ml)=[(A測(cè)定管-A空白管)÷ε÷d×V 反總×109]÷V ÷T

=536×(A測(cè)定管-A空白管)

ε:NADPH 摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm;V 反總:反應(yīng)體系總體積,1000μL=0.001 L;

1061mol=1×106μmol; Cpr:上清液蛋白濃度(mg/mL);V 樣:加入反應(yīng)體系中上清液體,100μL =0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,1mLW,樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,3min。

注意事項(xiàng):

1. 樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行,且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力。

2. 混合試劑和底物液須臨用前配制,配完后置于冰上,當(dāng)天使用完。

3. 測(cè)定過(guò)程操作須迅速。

4. 細(xì)胞中GSH-Px 活性測(cè)定時(shí),細(xì)胞數(shù)目須在300 萬(wàn)-500 萬(wàn)之間,細(xì)胞中GSH-Px 的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理,不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。

 

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

ELISA試劑盒免費(fèi)代檢測(cè)

CCK8檢測(cè)

HE染色

蛋白相互作用分析

Western Blot

免疫組化IHC染色

熒光定量PCR

動(dòng)物模型服務(wù)

流式細(xì)胞檢測(cè)

免疫熒光染色

激光共聚焦

DNA甲基化實(shí)驗(yàn)

石蠟/冰凍切片

透射電鏡服務(wù)

掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

蛋白雙向(2-D)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

免疫共沉淀

原位雜交(FIsh)

蛋白質(zhì)純化

分子克隆和質(zhì)粒載體構(gòu)建服務(wù)

組蛋白甲基化磷酸化乙酰化

 

蛋白雙向2D-WB

 

藥理毒理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

 

番紅O固綠染色

明膠酶譜MMP

酶活性檢測(cè)

動(dòng)物造模/模型實(shí)驗(yàn)服務(wù)

 

滬公網(wǎng)安備 31011802001678號(hào)

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