在應(yīng)用ELISA時(shí),首先要清楚下面內(nèi)容:1,是檢測抗體還是抗原?2,檢測的結(jié)果是定性還是定量?3,是否需要檢測特異抗體的類型?4,所用抗體/單克隆抗體的親和力怎樣?
(1)檢測抗原 zui常用于檢測抗原的方法是非競爭性的雙抗體夾心法,其次是競爭法。但競爭法在具體實(shí)驗(yàn)中有些困難,特別是檢測微生物的抗原,因?yàn)樾枰獦?biāo)記抗原,這對于某些抗原是很難做到的,甚至是不可能的。另外在競爭法中,酶標(biāo)記的抗原與標(biāo)本直接混合在一起,許多標(biāo)本中含有酶抑制劑或蛋白A樣物質(zhì),可影響ELISA的結(jié)果。
(2)檢測抗體 檢測抗體種類常用的方法是檢測抗體種類的捕獲法,這個(gè)方法常用于檢測特異性IgG、IgA和IgM.。這個(gè)方法的*步是捕獲所需要檢測的一個(gè)種類的抗體,接下來是檢測捕獲的抗體是否是特異性抗原的抗體。間接ELISA在檢測IgG時(shí)比較簡單,但不適用于檢測其他種類的抗體,因?yàn)檠逯腥绻刑禺?/span>IgG存在將與IgM或IgA等競爭結(jié)合抗原。
競爭法檢測抗體有兩種方法:一種是將標(biāo)記的抗體和標(biāo)本同時(shí)加入反應(yīng)孔內(nèi),但標(biāo)記的抗體和標(biāo)本中的抗體必須是結(jié)合抗原的不同決定簇;另一種是先加標(biāo)本,沖洗后再加標(biāo)記的抗體。競爭法檢測抗體比間接法容易判斷結(jié)果,并且比較敏感和特異。不論選擇哪種方法,ELISA都包括6個(gè)步驟:1,抗原或抗體吸附于固相;2.加標(biāo)本和試劑;3,孵育和沖洗;4,加酶標(biāo)抗原或抗體;5,加適當(dāng)?shù)牡孜铮?/span>6,檢測和分析結(jié)果。
雖然ELISA法在理論上十分簡單,但每一步都有要注意的事項(xiàng)。不論是新設(shè)計(jì)的ELISA還是沿用其他ELISA方法都有以下幾方面技術(shù)要點(diǎn):固相載體的選擇和試劑的制備,反反應(yīng)條件和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。