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細胞培養常見問題解決!
點擊次數:2312 更新時間:2018-08-10

實驗室經驗之總結(四十五):細胞培養常見問題解決!

1、如何儲存和解凍血清才不會使產品質量受損? 

建議血清應保存在-2O℃。若一次無法用完一瓶,無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內,再放回冷凍。將血清從冷凍箱取出后,置于2~8℃冰箱使之緩慢融解,一般是融解過夜。

 2、血清中包含絮狀沉淀,它們是什么,怎么處理? 

沉淀主要成分是纖維蛋白和脂蛋白,不會影響血清品質。 首先讓其沉淀在瓶子底部,中上層無沉淀血清直接轉出使用,下層血清裝到50ml無菌離心管,400g,離心3分鐘即可除去 (一般不建議采用過濾的方法除去沉 淀,因為沉淀會堵塞濾膜而無法過濾)。

3、實驗室如何選擇適合的血清? 

稀有的澳洲血清培養嬌貴細胞(小鼠ES、原代細胞分離培養),南美血清或國產胎牛血清用于癌細胞、常規細胞系培養(用量大),新生牛血清用于病毒包裝(構建穩轉細胞株)。

4、微生物培養基中添加了血清和抗生素后,可長期保存嗎? 

一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時,您應該在兩周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

 5、有必要做熱滅活嗎?

實驗顯示,經過正確處理的熱滅活血清,對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進,或*沒有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量,而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清,沉淀物的形成會顯著的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,像是“小黑點”,常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染,而把血清放在37℃環境中,又會使此沉淀物更增多,使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。 若非必須,可以不需要做熱處理這一步。不但節省時間,更確保血清的質量!

6、細胞培養中出現黑點是污染嗎?如何處理? 

一旦您在細胞培養的過程中發現有黑點生成,首先,要肉眼觀察微生物培養基是否混濁,然后,在鏡下觀察培養細胞生長的狀態,黑點是否游動。如果細胞被污染,微生物則會大量繁殖,微生物培養基就會迅速變黃、變混濁。污染包括細菌污染、支原體污染等。 如果在鏡下觀察細胞,生長狀態良好,與黑點出現前相比,沒有任何變化,那么,黑點的出現可能與以下幾種情況有關

(1)細胞生長過老,破碎的細胞殘骸;

(2)血清質量不好,反復凍融的結果;

(3)配制培養基的pH值偏高,不宜細胞生長;

(4)培養原代細胞中出現小黑點,可能是原代組織中的雜質,多次傳代可以消除。

 7、EDTA在細胞消化過程中起什么作用?

EDTA是一種螯合劑,它可以螯合Ca2+ 或Mg2+,而細胞表面很多和培養皿或培養瓶結合的蛋白都是帶有Ca2+ 或Mg2+的,把這些離子螯合后,可以加速細胞和培養皿的脫離,促進消化。上皮類細胞的連接存在“橋粒”結構,是細胞間“牢固”的連接,但橋粒的形成依賴于鈣離子的存在。在胰酶消化細胞時,加入EDTA,可以破壞細胞的橋粒結構,使細胞能夠分散成單個細胞。通俗地說,就是破壞細胞間的粘連。

8、如何選用特殊細胞系培養基?

培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。選DMEM做貼壁細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養。另外還可以參考ATCC的推薦信息。

9、 怎樣讓細胞適應新的條件?

從原條件逐漸過度:1/4、1/2、3/4,后是*新培養基。

10、為何微生物培養基保存于4℃,顏色會偏暗紅色?

(1).培養基內之CO2會逐漸溢出,造成微生物培養基越來越偏堿性。顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。

(2).培養基偏堿之結果,將造成細胞生長停滯或死亡。需調整pH值至7.0~7.2. 11、細胞凍存管應如何解凍? 37℃,1~2分鐘內全部融解。 冷凍管建議放在液氮液面上面,由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全(戴護目鏡),預防冷凍管之爆裂。

11、細胞凍存管應如何解凍? 可能原因:

(1)胰蛋白酶消化過度

(2)支原體污染

(3)消化液或培養液配制錯誤、過期儲存、儲存不當

(4)細胞老化(如傳代前細胞已匯合導致失去貼附性)

(5)接種細胞起始濃度太低或太高 解決辦法: 1. 準備一個培養容器,內裝合適體積的適宜培養基,并使其溫度和pH與建議的相稱 。 2. 在37℃或該細胞系正常生長溫度水浴下通過輕柔搖動迅速溶解凍存管(約2分鐘); 3. 管中內容物溶解后立刻將凍存管移到超凈工作臺內,并用70%酒精消毒表面防止污染,注意無菌操作。 4. 擰開凍存管蓋,將管中內容物轉移到已裝有少量培養液的無菌離心管中稀釋,離心(一般125g,10分鐘),棄去上清并用1~2ml*培養基重新懸浮沉淀細胞,然后轉移細胞懸浮液到培養容器內混合均勻。注意:如果凍存液中含5% DMSO,則不必離心,只需用15ml培養液懸浮即可。因為DMSO在這個濃度時沒有毒性。 5.24小時后檢查培養情況,如果需要的話進行擴傳。有些細胞系(比如雜交瘤細胞)從凍存狀態恢復需要幾天時間。 實際上,一些雜交瘤細胞在天培養液中出現死亡細胞并產生許多細胞殘骸。許多細胞凍存后活力下降并在融化后24小時到一個低狀態。此后細胞將恢復并進入對數生長期。細胞復蘇過程不是很難,主要是速溶這步很關鍵。再有,細胞復蘇的狀態如何,較大程度上取決于細胞凍存時的操作。還有一點,細胞也是有思想的,你對他好,關心他照顧他,他也不會讓你失望的。

DC2.4小鼠樹突狀細胞    B-CPAP細胞培養說明書

 

滬公網安備 31011802001678號

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