ELISA直接法測長葉車前花葉病毒(RMV)含量實驗步驟
1. 將不同濃度的待檢測RMV溶液作為樣品液,在測定板每孔各加250ul,至冰箱(4℃)中孵育過夜。
2. 孵育后,去除孔穴內抗原溶液,用PBS-Tween20溶液緩緩沖洗孔穴3次,每次3min,然后去凈洗滌液。
3. 每孔穴加250ulRMV的酶標記抗體溶液(用1%牛血清白蛋白的PBS- ween20稀釋)在恒溫箱(37℃)里孵育3-6h,或6℃下過夜。
4. 去除孔穴酶標記抗體溶液,用PBS-Tween20溶液緩緩沖洗3次每次3min,然后去凈洗滌液。
5. 每孔穴加入新鮮配備的底物溶液250ul,室溫放置0.5h,或者放置出現(xiàn)黃色。
6. 加入50ul3N NaOH,終止反應。
7. 對每孔穴的黃色溶液,測定449nm波長處的吸光值。
討論
1. 如該聚苯乙烯塑料微量反應板*次使用,應分別用標準濃度的RMV溶液、RMV的抗血清及RMV與它的IgG形成的免疫結合物,進行期盼滴定法來測該聚苯乙烯塑料微量反應板對RMV抗原和它的抗體的吸附能力。
2. 在正式測樣品前,用0.1mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液配置各種標準濃度的RMV溶液,依照實驗步驟測定RMV各種標準濃度的A449nm值,以病毒標準濃度為橫坐標,A449nm值為縱坐標繪制標準曲線,由此可以測出RMV包被的濃度。
3. 測出原始底物的吸光值,以便核準數(shù)據。
4. 對照標準曲線,就可算出樣品液中RMV的含量。
5. 如無牛血清白蛋白,可用0.1%白明膠代替。
6. 對于不穩(wěn)定的病毒,用中性緩沖液稀釋。
7. 如有ELISA測定儀,可快速測定。
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